아가로스 겔 전기영동 실험 |
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| 작성자 | 의생명진로집중 | 등록일 | 19.07.10 | 조회수 | 2084 |
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준비물 - Sample A 연보라 500μℓ - Sample B 노랑 500μℓ - Sample C 주황 500μℓ - Sample D 파랑 500μℓ - Sample E Unknown 1 500μℓ - Sample F Unknown 2 500μℓ - Premade Agarose gel(1.5% TAE) - 50X TAE buffer 30mL - 일회용 마이크로피펫 6개 - 일회용 스포이드 1개 - 전기영동장치 - e-튜브 랙 - 500mL 메스실린더 - 증류수 -마이크로피펫 학습내용 아가로스겔 전기영동은 높은 해상력을 가지면서도 실험은 단순하고 간단하여 전하, 크기, 모양을 토대로 분자를 분리하기 위해 널리 사용되고 있으며 특히 DNA, RNA, 단백질과 같은 전하를 띈 생체분자를 분리하는데 유용하다. 전기영동을 위한 샘플은 glycerol 혹은 sucrose같은 혼합 농도를 주는 것과 섞어서 준비하는데. 이는 전기영동 버퍼보다 점도가 높은 샘플을 만들기 위해서이다. 마이크로피펫을 이용해 겔의 웰(구멍)안으로 샘플을 로딩 한다. 샘플의 밀도에 의해 버퍼에 가라앉게 되고 웰 안에 고정이 된다. 직류 전원장치를 전기영동장치에 연결한고 전류를 공급해주면 샘플내의 전하를 띈 분자가 웰의 벽을 통해 겔 안으로 들어가게 되는데 이 때 음극성을 띈 분자는 양극을 향해 이동하고 반면 양극성을 띈 분자는 음극을 향해 이 동을 하게 된다. 이 상태에서 전압의 공급이 높을수록 샘플의 이동속도는 빨라지게 된다. 버퍼는 전도도 역 할을 하게 되며 또한 PH를 조절한다. 전하와 생물학적인 분자의 안정을 위해 pH는 중요하다. 아가로스는 Agar의 Polysaccharide 파생어이다. 이 실험은 Premade Agarose Gel을 사용한다. 이 물질은 아 가로즈와 hydrocolloid의 혼합물로서 겔을 맑고 탄력있게 해준다. 겔은 미세한 구멍을 가지며 이것은 분자를 걸러내는 역할을 하게 된다. 겔의 걸러내는 특성은 분자 이동률에 영향을 준다. 작은 크기의 분자가 큰 것보 다 더 빨리 구멍을 통과하며 이동을 한다. 분자는 같은 분자량과 전하를 가질 수는 있지만 형태는 서로 다 르다. 분자는 더 조밀한 모양을 가지고 있다. 막대보다 더 조밀한 구형 분자는 구멍을 통해 더 빠르게 이동 할 수 있다. 전하, 크기, 모양 요소는 버퍼상태, 겔 농도, 전압과 함께 겔의 분자 이동성에 영향을 준다. 분자량과 모양이 같은 두 분자가 주어진다면 전하의 양이 많은 것이 더 빨리 이동하게 된다. 게다가 다른 분자는 다양한 등 급으로 아가로스에 작용하게 된다. 아가로스에 더욱 강하게 묶인 분자는 느리게 이동하게 된다. 이 실험에서 여러 개의 다른 염색 샘플은 아가로스 겔 전기영동에 공급되고 이동속도와 방향이 관찰되게 된 다. 염료 A, B, C, D 는 중성 PH에서 음극을 띄게 된다. 그러나 이 분자들은 그들의 구조, 화학적 구성, 이동 시키는 전하의 양적인 상태는 다르다. 안전 유의 사항 1. 보호장갑 및 보호안경을 착용한다. 2. 시약을 가열하거나 녹이는 장비를 다룰 때에는 특별히 주의해야 한다. 3. 입으로 피펫을 사용하지 않는다. 피펫 펌프나 벌브를 사용한다. 4. 전기 장비를 사용 할 경우 특별히 조심한다. 사용하지 않을 때는 파워를 끄고 플러그를 뽑는다. 5. 항상 시약이나 생물학적 물질을 다루는 실험이 끝나면 비누로 손을 깨끗이 닦는다. 실험과정 1. 먼저 50X TAE Buffer 약 3ml를 스포이드로 떠서 증류수 297ml에 넣어 0.5X TAE buffer 300ml를 만든다. 2. 샘플들의 뚜껑을 열어 순서대로 e-Tube rack에 꽂는다. 3. 겔을 전기영동장치에 올려 놓고, 0.5X TAE buffer를 겔이 잠기도록 탱크에 붓는다.(약 250~300mL) 4. 샘플을 A부터 F까지 차례로 옮긴다. 마이크로피펫 이용↑20μℓ  5 전원을 키고, 전류가 잘 흐르고 있는지 확인한다.  6. 약 10분 후에 색깔 있는 염료가 분리되는 것을 관찰한다. 7. 약 30분 후 전기영동이 끝나면 전원을 끄고, 커버를 열어 아가로스겔을 꺼낸다.  8. 겔 사진을 찍는다 |
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